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代写论文

人DNA拓朴异构酶I重组表达及条件优化

作者:代写论文  来源:http://www.starlunwen.com/  发布时间:2011-02-28 21:03:32

摘要:为了在体外以人DNA拓扑异构酶I(hTopo I)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用rt-pcr法从HepG2细胞中克隆了hTopo I基因ORF并在毕赤酵母中成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoI)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoI和KM-hTopoI)更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY(pH7.25),每隔24h补加0.5%(vV/V)的甲醇和3%(V/V)的营养液,SMD-hTopoI诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/ml),发酵上清中hTopoI可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和免疫印迹分析显示,表达的hTopoI为91kDa蛋白,无糖基化修饰。
关键词:人DNA拓扑异构酶L,分泌表达,优化,毕赤酵母

DNA 拓扑异构酶(DNA topoisomerase)通过调节DNA的拓扑结构,在细胞代谢过程中起着极重要的作用,如 DNA 复制、基因转录、DNA重组、有丝分裂等1 2。DNA拓扑异构酶组成了 Type I和Type II两个家族。Type I酶改变 DNA双螺旋的拓扑结构时,不需要 ATP 供能,一次仅切割 DNA双链中一条链。Type II酶改变 DNA双螺旋的拓扑结构时,需要 ATP提供能量,一次同时切开 DNA的双链3。除细菌的DNA拓扑异构酶(即旋转酶,gyrase)能将负超螺旋引入 DNA中,其余 DNA拓扑异构酶能松驰 DNA链中的超螺旋1。真核生物 DNA拓扑异构酶I或II被证实为多种抗肿瘤药物的有效靶位,细菌的gyrase也是临床上广泛使用的喹喏酮类抗生素的作用靶位4 5。
人 DNA拓扑异构酶I(.hTopo I)为 91kD 的单肽,有765个氨基酸6。该酶由位于染色体20q12-13.2位点的单拷贝基因编码7,在细胞中含量甚微。.hTopo I在酿酒酵母、昆虫细胞及肿瘤细胞中得到了表达8-10,但表达量都十分低,这是因为表达的具有活性的hTopo I在宿主细胞内会影响细胞正常的代谢过程11 。在细胞内表达后,.hTopo I的分离纯化步骤也十分复杂,且在分离纯化过程中酶活性极易丧失。为了获得足够的酶供研究和应用,本文应用了毕赤酵母表达系统。毕赤酵母(Pichia. Pastoris)有α信号肽引导,表达产物能分泌到发酵液中,易于纯化;它还有甲醇诱导型强启动子,外源蛋白的表达产量高12 13。本研究利用毕赤酵母中成功表达了hTopo I全长蛋白并进行了表达条件的优化,表达产物性质稳定,产量较以往的方法高。表达产物经过简单的超滤制备,即能满足体外以hTopo I为靶位抗肿瘤化合物的快速筛选。
1 材料与方法
1.1材料
pBR322、pPICZαA、P.pastoris SMD1168(his4 ura3 pep::URA3, Mut+)、KM71(his4 aox1::ARG4, Muts)为本室保存公司产品。
1.2 方法
1.2.1 hTopo I基因ORF的克隆和表达载体的构建:处于对数生长期的HepG2细胞中提取中的RNA,使用ThermoScript TM RT-PCR试剂盒和hTopo I ORF的下游Primer(B)(5’ ATAGGTACTTACTAAAACTCATAGTCTTCATCAGC 3’,含Kpn I位点),以hTopo I mRNA为模板进行逆转录,合成hTopo I cDNA 第一链。再以此为模板,用hTopo I ORF的上有Primer(A)(5’ ATAGAATTCATGAGTGGGGACCACCTCCAC3’,含EcoR I位点)和Primer B通过PCR合成全长hTopoI ORF(2295bp)。引物设计依据发表的序列(GeneBank Accession No.J0325)[6]。PCR条件为94℃变性5min,然后94℃ 30s→56℃ 40s→72 ℃ 2min进行30循环,最后72℃延伸10min。合成的hTopoI ORF片段含有2个终止子,将PCR产物与载体pPICZαA用EcoRI和KpnI双酶切后,ORF与pPICZαA相连接构建出表达载体pPICZα-hTopoI.
1.2.2 毕赤酵母的转化与hTopo I的表达  
方法:将pPICZα-hTopoI经过SacI酶切,线性化后的表达载体用电转化方式导入毕赤酵母MD1168、X33、KM71并与宿主的基因组发生同源重组。整合后的
pPICZα-hTopoI除在毕赤酵母中表达hTopoI外,还会表达zeocin抗性蛋白而起筛选作用。Zeocin抗性蛋白在宿主细胞内不是以酶解的方式分解zeocin,二十余zeocin按一定化学剂量结合,使zeocin失效,这样,整合到毕赤酵母基因组中重组质粒的拷贝数越多,zeocin抗性蛋白表达量就越高,其耐受高浓度zeocin的能力就越强,表达hTopoI的能力也可能提高。因此,可方便地从含高浓度zeocin的培养基中直接筛选得到高拷贝重组子14。用含1000μg/mlzeocin的YPDS筛选的重组酵母可表达hTopoI,并在α-factor引导下分泌到发酵上清中。
Mut+表型(甲醇利用野生型)重组酵母的表达:接种重组酵母于BMGY培养液中(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,1.34%酵母氮源,4×10-5生物素,1%甘油和100mM pH6.0的磷酸钾缓冲液),30℃ 250转/min培养至OD600为2-6,室温离心5min后收集细胞,加入原培养体积4倍的BMMY(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%甲醇和100mM特定pH值磷酸盐缓冲液)重悬细胞,盖4层纱布,在一定温度下250转/min表达hTopoI每隔24h不加一定量的甲醇诱导表达。
Muts表型(甲醇利用迟缓型)重组酵母的表达:接种重组酵母于BMGY中,30℃250转/min培养至OD为2~6,室温离心5min收集细胞,加入原培养体积1/4倍的BMMY重悬细胞诱导表达,其余条件同上。
1.2.3 重组酵母基因组PCR分析:重组酵母基因组的提取参考EasySelectTM Pichia Expression试剂盒说明。PCR使用两对特异引物,即hTopoI ORF的Primer A和B,P. pastoris AOX1基因的上游引物5’ GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’ 和下游引物5’ GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’
1.2.4 表达产物的酶活力分析:酶活力单位定义:在20μlhTopoI反应体系(35mMpH7.5 Tris•HCl,50mMKCl,5mM MgCl2,1 mMDTT,2mM亚精胺,0.1mMEDTA,50μg/mlBSA)中,能在37℃30min松弛0.5μg负超螺旋pBR322所需的hTopo,为1个单位(u)的酶量。
在共20μl,hTopo I反应体系中,加入4μl 5×反应缓冲液(175mMpH7.5 Tris•HCl,250mMKCl,25mM MgCl2,5 mMDTT,10mM亚精胺,0.5mMEDTA,250μg/mlBSA ),0.5μg负超螺旋pBR322,适当体积的发酵上清,或其稀释液(加入量为1μl)15。37℃反应30min后,加入4μlhTopoI反应终止液(6×)(3%SDS,60mMEDTA,50%甘油,0.25%溴酚蓝)。使用1%琼脂糖,0.5×TBE,1.5-4V/cm于是问电泳2-8小时,电压低,电泳效果好。电泳完毕,用0.5%溴化乙锭染色30min,再用去离子水漂洗30min,凝胶成像仪下拍照。若能使0.5μg负超螺旋pBR322全部松弛的发酵上清的最大稀释倍数为A,则发酵上清的的酶活力为A×103 u/ml。

2 结果
2.1 重组酵母基因组PCR分析
从含1000μg/ml zeocin的YPDS平板上挑取重组酵母,YPD上传代10次,提取基因组,分析外源基因在重组酵母中的稳定性。在重组酵母基因组中PCR分析结果见图1。从图中可以看出使用AOX1的引物扩增KM-hTopoI基因组后,hTopoIORF前面融合有约300bp α信号肽剪辑序列,故扩增出约2.6kb的片段。在KM-hTopoI基因组中,野生型AOX1基因的BamHI 和Sal I位点间插入了ARG4基因(约2kb)而使其失活,这个突变的aox I::ARG4基因太长未能扩增出来。使用AOX1的引物扩增X33-和TopoI和SMD-hTopoI表达盒,使用AOX1的引物空载体转化的X33和MD1168基因组时(lane 4 和8),扩增产物除2.6kb的hTopoI表达,还出现更明亮的野生型AOX 1基因条带,使用AOX1的因物扩增空载体转化的X33和MD1168基因组时(lane 3和9),仅有AOX1基因条带。使用hTopoI的特异引物扩增km-htopoI、X33-hTopoI和SMD-hTopo I基因组时(lane 2、5和7),扩增产物有和TopoIORF条带。证明hTopoI基因正确整合如KM 71,X33和MD1168基因组中且稳定。
 
图1:重组毕赤酵母PCR分析结果,1,4,8道使用AOX1引物对KM-hTopoI,X33-hTopoI和SMD-hTopoI3种酵母株进行PCR的泳道,3,9为X33和SMD1168基因组条带;2,5,7为利用hTopoI引物对KM-hTopoI,X33-hTopoI和SMD-hTopoI3进行扩增的条带。
2.2 三种重组酵母表达hTopoI比较
从含1000μg/mlzeocin的YPDS平板上挑取SMD-hTopo I、X33-hTopoI各5株,5株KM-hTopoI均为Muts表型而另外两种均为Mut+表型。重组酵母在BMMY(pH6.0),于30℃250转/min,每隔24h补加0.5%甲醇诱导表达。于不同诱导时间取发酵上清进行酶活力测定,测得3种重组酵母都是在72h时酶活力最高。用空载体转化的宿主菌作对照时,其发酵上清均未检测到酶活力,以下实验均有对照,不再赘述。结果表明,同类重组酵母表达的酶活力水平相近。此外,SMD-hTopoI表达的酶活力水平最高。图2显示SMD-hTopoI诱导72h时酶活力测定结果。此时,加样1μl,发酵上清酶活力为4000u/ml。
表1:毕赤酵母诱导72h后hTopoI在3种酵母株中表达情况
 
 
图2:SMD-hTopoI发酵上清酶活力测定结果
2.3 SMD-hTopoI发酵条件的优化
选用表达量最高的一株SMD-hTopoI进行表达条件优化
2.3.1 甲醇诱导浓度:SMD-hTopoI在BMMY(pH6.0),于30℃,每隔24h加入0.5%或1%甲醇进行诱导,结果表明,两种条件时发酵上清的酶活力在相同时间基本无显著差别。
2.3.2 pH值使用不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0)的BMMY。结果发现pH7.0时,在72h时酶活性显著高于其余pH组检测值,pH为4.0时检测不到酶活性。最高的酶活力均出现在72h。在以上结果基础上,提高BMMY pH值至7.25,7.5,结果发现pH为7.25时酶活力最高。
 
图3:pH对SMD-hTopoI表达hTopoI的影响
2.3.3 温度:使用pH7.25的BMMY每隔24h加入0.5%的甲醇,在15℃,20℃,25℃和30℃下进行表达。结果表明在不同的温度下,酶活力的高峰都出现在72h时。在较低温度下(15℃和20℃下),酶活力明显提高,最高的酶活力可以达到32000u/ml。
 
图4:温度对SMD-hTopoI的影响
2.3.4 补加营养液:使用BMMY(pH7.25)每隔24h加入0.5%的甲醇和3%的营养液,在20℃进行表达。结果表明,酶活力高峰仍然在72h出现。补加营养液对表达有明显帮助。未加营养液的发酵上清在72h的酶活力为26000u/ml,补加营养液时则为43000u/ml。
2.3.5 酸水解干酪素:表达条件同上,于24h时加1%的酸水解干酪素。同时用不加干酪素的发酵品为对照。结果表明,酸水解干酪素对表达hTopoI无帮助。
3 讨论
毕赤酵母的蛋白水解酶基本储藏在液泡内,主要有3种,既蛋白酶A、B及羧肽酶Y。蛋白酶A由基因PEP4编码,在液泡中可自我激活,而蛋白酶B由基因PRB1编码,越有50%是以需要蛋白酶A水解激活的前体形式存在。羧肽酶Y发挥活性前全都要蛋白酶A水解激活16。在表达过程中,由于少量细胞破裂,有部分蛋白酶释放到发酵液中,导致产物表达不稳定或是被降解。SMD-hTopoI由于蛋白酶A突变失活,因此缺失了全部的蛋白酶A和羧肽酶Y活性,仅存部分蛋白酶B活性,这样非常有利于发酵液中hTopoI的稳定。实验表明,SMD-hTopoI表达产量明显高于另外两种酵母株。酸水解干酪素可以抑制发酵上清中蛋白水解酶的活性,从而增加重组蛋白的稳定性。但发酵SMD-htopoi时,在培养基中缴入酸水解干扰素对提高hTopoI表达产量无帮助,可能的原因在于此时培养液中本身仅有很少的蛋白酶活性。
毕赤酵母的最适生长温度在25~30℃之间。作者在不同的温度下表达hTopoI,发现15℃和20℃酶活力最高。从酵母的生长来看,15℃和20℃生长3天的细胞密度明显小于25℃和30℃,但发酵上清酶活力却高出许多,原因有待进一步探讨。hTopoI在宿主细胞中表达以后,虽有α-factor引导分泌到细胞外,但在N端还有其自身的核定位信号17 18,故仍有一部分hTopoI被引导到细胞核,并在核内发挥功能11。细胞核中过高的DNA拓扑异构酶I活性必然导致酵母细胞代谢的改变,细胞适应这种状态后才能开始大量表达它们,而此时培养基中营养所剩不多,因此,通过向发酵液中逐步添加营养液可以有效提高hTopoI的酶表达量。
这样通过发酵条件的优化,我们得到了一个综合表达条件:使用BMMY(pH7.25),于20℃,每隔24h补加0.5%的甲醇和3%的营养液,SMD-hTopoI诱导72h时表达的酶量可以达到最高。

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