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细胞穿膜肽入胞检测方法概述

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作者:原作原创  来源:网络转载  发布时间:2015-09-17 16:58:00

   摘要:迄今为止,已有多达上百种的细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)被发现报道,但这类多肽分子的入胞能力参差不齐,限制了其作为药物载体的应用。虽然已有多种实验方法可用于细胞穿膜肽入胞的检测,但由于缺乏通用的技术来确切证实CPPs的入胞能力,所以应当结合使用多种方法以降低误差。对不同的技术在检测CPPs入胞时的优缺点进行比较,并针对性地提出比较理想的解决方案,可为制订CPPs入胞标准化检测步骤提供一些参考。 
  关键词:细胞穿膜肽:荧光分析;电子显微镜;生物效应 
  中图分类号:Q819 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2015)01-0080-05 
  AnOverviewofDetectionMethodsofTransmembraneAbilityofCell-penetratingPeptides 
  YANGCheng-liang1,ZOULi-li2* 
  (1.ThePeople,sHospital,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002,Hubei,China;2.MedicalSchool,ChinaThree GorgesUniversity,Yichang443002,Hubei,China) 
  Abstract:Hundredsofcell-penetratingpeptides(CPPs)havebeenfoundandreported.Sincetheirtrans-membraneabilitiesareuneven,limitingtheirapplicationasthedrugcarriers,yetneedsomeeffectiveanaly?sistechniquestocompare.AlargenumberofexperimentscanbeusedtodetectthepenetratingabilitiesofCPPsintothecells,sincethereisnouniversalmethodcanconfirmthecapacity,avarietyofmethodsshouldbeusedinconjunctiontoreducetheerrors.ThuscomparingtheadvantagesanddisadvantagesofdifferentdetectiontechniquesofpenetratingabilitiesofCPPsintocellscanraisetheidealsolutioninordertostan-dardizethedetectionsteps. 
  Keywords:cell-penetratingpeptides;fluorescentanalysis;electronmicroscopes;biologicaleffect 
  (LifeScienceResearch,2015,19(1):080?084) 
  1965年,Ryser等研究发现哺乳动物细胞摄取组蛋白的速度是血清白蛋白的3000倍,并且血清白蛋白中加入组蛋白后能显著提高肿瘤细胞摄取血清白蛋白的能力(50倍),这是研究史上首例关于多肽分子能协助生物活性分子穿过细胞脂质双分子层的报道[1]。1994年,这种具有穿膜能力的多肽分子被正式命名为细胞膜穿透肽(cell-pene-tratingpeptides.CPPs)或蛋白转导结构域(proteintransductiondomains,PTDs)[2]。CPPs是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能携带生物活性物质进入细胞内,既不影响转导物质的生物活性也不会损伤细胞,是一种非常理想的运载工具。但CPPs的入胞能力参差不齐,限制了其作为药物载体的应用,因而需要一些确切的手段对CPPs进行筛选、比较。许多课题组在评估CPPs穿膜时,都有自己最优先的方法,但这些方法是否最适宜却值得考量。本文拟比较不同的技术检测CPPs穿膜的优缺点,并针对缺陷提出比较理想的解决方案,以期为CPPs穿膜标准化检测进程提供一些参考。 
  1荧光分析 
  荧光分析法是评估cpps穿膜最常见的方法。多肽分子首先用荧光素标记,然后通过不同的技术手段对穿膜效率进行检测,包括荧光显微镜观察、高效液相色谱法、荧光激活细胞分选术、荧光光谱测定法。如Fischer等成功应用荧光显微镜比较了来源于果蝇触角基因同源结构域蛋白(antennapediahomeodomainprotein,AntpHD)的多肽分子与来源于卡波氏瘤成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)的膜上转移序列(membrane trans-locatingsequence,MTS)的入胞效率,结果显示AntpHD来源的多肽分子是FGF来源的多肽分子穿膜效率的3~4倍[3]。尽管所有的荧光分析技术都能检测CPPs的穿膜,但需要注意的是考虑到荧光可能粘附在细胞表面,因此即使检测到荧光基团的摄取也不能直接等同于多肽分子的穿膜。此外,某些荧光基团可能会对多肽分子的穿膜效率及胞内分布产生影响[3-5](表1)。 
  1.1荧光显微镜观察 
  使用荧光显微镜除了能提供CPPs的穿膜信息以外,它的另一个优势是能够利用白光下的细胞形态及染色(例如碘化丙啶)情况来确定细胞活性,因为只有细胞膜受损的细胞才能被染色。2001年以前,研究者利用荧光显微镜探讨CPPs的穿膜机制时都是观察多肽分子进入固定细胞的情况。然而,Lundberg等发现由于荧光显微镜并不能分辨多肽分子是结合在细胞膜上还是进入细胞内,因而一定程度上影响了结果的准确性[6]。近年来新兴的共聚焦显微镜因其具有完整显示活细胞聚焦平面的能力,弥补了荧光显微镜观察的技术缺陷如Richard等成功利用共聚焦显微镜观察到TAT及多聚精氨酸(polyarginine)进入细胞内并主要定位于细胞核[7],因而特别推荐荧光显微镜配合使用共聚焦显微镜进行观察,能准确地对CPPs进行亚细胞定位,使得对CPPs穿膜的检测更具说服力。Jones等成功应用共聚焦显微镜结合荧光显微镜观察了antennapadia(Antp)及TAT的穿膜情况,结果显示两者均穿膜进入了细胞内,并且穿膜作用是脂筏依赖的内吞作用而非网格蛋白依赖的内吞作用[4]。

  虽然荧光显微镜几乎是唯一能定性分析CPPs入胞的方法,并且这种技术应用非常广泛,但它较费时费力且不能同时分析多个样本。此外,CPPs进入细胞后并不十分稳定,容易发生降解,从而导致图像不清晰。因而特别推荐荧光显微镜结合使用其他的观察技术来确定多肽分子是完整的还是降解的,以保证结果的准确性。如Adams等成功利用荧光共振能量转移实验(fluorescence resonance energy transfer,FRET)实时分析细胞穿膜肽H2N-aha-R-CONH2及H2N-GGR10-CONH2对HeLa细胞的穿膜,结果发现两者的入胞都具有时间依赖性,并且最终入胞的完整多肽分子与在胞外时基本持平[8、9]。 
  1.2高效液相色谱法 
  多肽分子的降解是影响CPPs穿膜测定的重要因素,如Oehlke等将经过化学修饰的多肽分子FLUOS-KLALKLALKALKAALKLA-NH2,吸附在细胞膜表面以增加胞膜的疏水性,同时发现这种经过修饰的多肽分子发生降解的几率显著降低[10]。此实验强调了多肽分子降解的重要影响。反相高效液相色谱法(reversed-phasehighperformanceliquidchromatography,RP-HPLC)可利用待测样品中各成分与色谱柱中固定相发生作用的不同,在检测器中出现不同的信号峰,从而将完整的多肽分子与发生降解的多肽分子区分开来。Palm等成功地运用KP-HPLC定量分析了MAP及pene-tratin在细胞内的降解情况,结果显示进入细胞内的多肽分子呈两极分化趋势,其中一部分迅速降解,另一部分一直保持稳定[11]。虽然RP-HPLC可有效定量测定入胞及降解的多肽分子,但由于该色谱分析法是建立在待检成分与间定相相互作用的基础上的,因而对组成多肽分子的氨基酸种类有一定的要求,并且HPLC价格昂贵,一般实验室没有这个设备且仪器的操作需要一定的经验,因而不是十分经济便利。 
  1.3荧光激活细胞分选术 
  检测CPPs穿膜最经典的荧光分析法是荧光激活细胞分选术(fluorescence activatedcellsorting,FACS),这是一种依赖荧光对单一细胞系进行分选的技术,通过这种方法可在定量分析CPPs穿膜的同时辨别靶细胞是活细胞还是死细胞此外,cpps孵育后必须用酶处现细胞,例如胰蛋白酶或链酶蛋白酶,可去除结合于膜上的多肽分子,因此FACS最大的优势是能够测定CPPs的转导比率(多肽分子进入一个细胞内的CPPs的量)[7]。大部分荧光技术都不能确定多肽分子是结合在细胞膜表面,是锚定在膜上还是进入细胞内的,而荧光激活细胞分选术能弥补这个缺陷。如Jones等成功应用FACS对Antp、TAT、transportan(TP)及polyarginine的穿膜情况进行了比较,研究发现它们在胞内表现出非常相似的代谢动力学特性,此外polyarginine与TP携带货物的能力最强(pol-yarginine=TP>Antp>TAT),而Antp的细胞毒性最低(Antp

  4生物效应 
  CPPs被定义为经典的运载工具,这意味着它们可被广泛应用于不同货物的运输。虽然荧光分析技术可高效地用于新CPPs的初筛,但最近大量研究都表明荧光的吸收会产生不可避免的生物应答,如荧光标记的寡核苷酸或其类似物如肽核酸(PNA)与CPPs结合入胞后可引起剧烈的生物反应,因而考虑生物效应的分析方法是更佳的选择[12、17-20](表1)。 
  4.1链接校正 
  使用链接校正寡核秆酸(SCOS)来评估CPPs递送货物的能力是近几年十分常见的研究手段,此方法最初由Kole等于1998年建立。HeLapluc705细胞稳定转染荧光素酶,报告基因被含有一个异常剪接位点的来自β-珠蛋白的前体mRNA打断,异常剪接位点激活潜在的剪接位点,在正常情况下会产生非功能性的荧光素酶;若引入SCOS互补绑定异常剪接位点,剪接后则会产生功能性荧光素酶。因而可通过结合不同的CPPs到潜在剪接位点的互补SCOS,评估CPPs作为药物载体的能力[21]。如Lehto等通过链接校正技术对硬脂酰改造的(RxR)(4)进行分析时发现,该CPP具有强大的运载货物的能力[20]。由于剪接发生在核内,这种分析手段可给出SCOS在胞内的分布情况及CPP-SCOS复合体是否发生内囊泡逃逸等相关信息,是一种优于荧光分析技术的检测手段[22]。但是链接校正技术需要特殊的细胞系HeLapLuc705,且该检测依赖于荧光素酶底物的发光,不是十分经济。 
  4.2Cre-重组酶 
  基于Cre-loxP系统的检测技术是另一个比较理想的用于确定CPPs携带货物能力的方法。这是目前国内外研究和应用比较广泛的一种位点特异性重组系统,主要包含两个部分:一个是loxP位点,另一个是识别loxP位点的Cre-重组酶。Cre-重组酶是一种无须辅助因子便能催化loxP位点之间的DNA特殊位点重组的拓扑异构酶。Wadia等将Cre-loxP系统用于CPPs转导蛋白入胞的检测,TAT-Cre蛋白被转导到包含loxP-STOP-loxP的增强型绿色荧光蛋内基因(enhancedgreeniluorescentprotein,EGFP)的小鼠T细胞中,Cre-重组酶切除了STOP片段从而抑制了EGFP的表达,因其非特异性毒性且不干扰结果,具有明显的优势[23]。此技术虽然特异性非常强,但它依赖于CPP-Cre的表达,相当费时费力且很难取得足够的蛋白量,因而未得到普及。此外,Cre-重组酶是一个相对分子质量相当大的货物,会影响CPPs的性状。 
  4.3凋亡与增殖 
  绝大多数CPPs的潜在用途是作为载体运输药物到人或动物,而CPPs在癌症领域的应用主要是为了增加细胞凋亡以减少细胞增殖,如Aroui等研究发现,阿霉素阻碍肿瘤细胞的增殖的同时可引起抑制凋亡的原癌基因Bcl-2的过表达,从而阻碍细胞凋亡的发生,而利用CPP运送阿霉索在有效阻碍MDA-MB231乳腺癌细胞的增殖同时,可驱动其他的细胞凋亡途径[24]。虽然CPRs已被成功用于癌症治疗中化疗药物的运送载体,但新的研究发现这种应用还有继续改良的空间,利用此方法的主要目的是监控阻止肿瘤细胞增殖,但大量的研究发现CPPs的非特异性非细胞毒性可能会对治疗效果发生干扰,而不能体现运送的货物的相应生物学效应[24]。 
  迄今为止,有许多不同的方法可用于评估CPPs的入胞能力,但单一的检测技术各有优缺点,不能确切地证实CPPS的入胞能力。建议结合使用几种方法,以弥补各检测手段的缺陷,防止假阳性结果的出现。 
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