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香蕉皮多酚氧化酶特性研究

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作者:原作原创  来源:网络转载  发布时间:2017-01-10 13:44:00

           香蕉属芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)的多年生草本植物,香蕉含有丰富的营养成分,且质地柔软,味道鲜美,是世界四大水果之一。但是香蕉作为呼吸跃变型水果很难储存运输,酶促褐变不仅影响香蕉外观、风味、营养和加工性能,而且还大大降低耐贮性。香蕉皮是香蕉的主要废弃物,约占果实重量的30%,其多酚氧化酶是影响酶促褐变的主要原因,多酚氧化酶会催化多酚氧化为醌,醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应,产生黑色素沉淀,相应研究也较多。本试验对香蕉皮多酚氧化酶的特性进行研究,为香蕉贮藏和加工应用提供理论依据。 
  1材料与方法 
  1.1材料 
  香蕉,取市场售卖香蕉Musa nana Lour,新鲜无黑斑、无病虫害、无机械伤、大小均匀、组织完好的为试验材料。 
  1.2方法 
  1.2.1 PPO粗酶液的制备。取新鲜香蕉皮6g,加2.5倍量的pH值6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液,冰浴研磨至匀浆。然后再以8000r/min、4℃冷冻离心机离心5min,上清液即为PPO粗酶液。 
  1.2.2测定波长的选择。取pH值6.0的磷酸盐缓冲液2mL,加入0.2mol/L的邻苯二酚溶液1.0mL,0.1mLPPO粗酶液至比色皿中,室温下迅速混合。香蕉皮PPO的最适波长在400~420nm,试验操作过程中测得在波长400~420nm只有1个峰值,且香蕉皮PPO多酚氧化酶的褐变产物在波长414nm处之后吸光度变化值(OD值)明显一直降低,故分别在波长400、402、404、406、408、410、412、414nm处测吸光度变化值(0D值)进一步确定最适波长。酶液加入后开始测定反应产物的吸光度,每15s记录1次吸光度,共记录30s内的吸光度的变化值。并且重复测定3次取平均值。 
  1.2.3酶活力与pH值的关系。在30℃时,于pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.8、9.0的一系列磷酸盐缓冲液2mL中,分别加入浓度为0.2mol/L的邻苯二酚溶液ImL,PPO粗酶液0.1mL,按照1.2.2方法测定在波长404nm处不同pH值时的吸光度的变化值,重复测定3次取平均值。 
  1.2.4酶活力与温度的关系。取pH值6.0的磷酸盐缓冲液2mL、浓度为0.2mol/L的邻苯二酚溶液ImL和PPO粗酶液0.1mL分别在0、5、10、1 5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃的水浴中水浴5min,取出迅速冷却至室温,再按照1.2.2方法测定在波长404nm处不同温度时的吸光度的变化值,重复测定3次取平均值。 
  1.2.5酶活力与底物浓度的关系。在30℃时,在2mL磷酸盐缓冲液中分别加入浓度为0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20、0.225、0.25mol/L的邻苯二酚溶液lml和PPO粗酶液0.1mL,迅速摇匀。按照 
  1.2.2方法测定在波长404nm处不同底物浓度时的吸光度的变化值,重复测定3次取平均值。 
  1.2.6酶活力与褐变抑制剂的关系。30℃时,在2mL磷酸盐缓冲液中加入底物浓度0.125mol/L邻苯二酚0.1mL,分别加入(0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L)柠檬酸0.1mL、(0、0.01、0.02、0.03、0.04mol/L)亚硫酸氢钠0.1mL、(0、0.0025、0.0050、0.0075、0.01mol/L)抗坏血酸0.1mL、(0、0.0025、0.0050、0.0075、0.01mol/L)EDTA-2Na 0.1mL,粗酶液0.1mL,保温10min,按照1.2.2方法测定在波长404nm处不同底物浓度时的吸光度的变化值,重复测定3次取平均值。 
  1.2.7酶活力与酶液保存时间的关系。提取的新鲜PPO粗酶液放置在4℃冰箱中保存7天。每天同一时刻取出部分PPO粗酶液进行试验,于2mL磷酸盐缓冲液中加入0.125mol/L的邻苯二酚溶液1mL,PPO粗酶液0.1mL,30℃水浴加热5min后取出迅速冷却至室温然后迅速摇匀,按照1.2.2方法测定在波长404nm处的吸光度的变化值,重复测定3次取平均值。 
  2结果与分析 
  2.1反应体系波长的测定 
  反应产物在波长400~414nm下的吸光度的变化值如图1。由图1得出反应产物在波长404nm处有最大吸收峰,即在此吸收波长处反应产物有最大吸光度的变化值。因此确定在以后的测定中都以波长404nm为测定工作波长。 
  2.2酶活力与pH值的关系 
  经测定,pH值不同时反应产物的吸光度的变化值如图2所示。从图2可知,反应体系pH值对香蕉皮PPO酶活力的影响比较明显,在pH值4.5和6.5有最大吸光度的变化值,说明在pH值4.5和6.5时香蕉皮PPO酶活力较大,且在pH值6.5时最大;在pH值<4.5时,酶活力随着pH值的降低也逐渐降低;在pH值<3.0时,香蕉皮PPO活性明显被抑制;而在pH值>6.5时,随着pH值的逐渐增大,酶活力仍然逐渐减小;当pH值>7.5时,酶活力得到了明显的抑制。主要原因是PPO为碱性蛋白,在较强的酸性条件下,辅基铜将以铜离子的形式解离出来,从而使酶失活;而在碱性条件下辅基铜会解离成Cu(OH)2,使酶活力明显降低。同时由图2看到香蕉皮PPO在pH值为4.5和6.5有2个吸收峰,这表明香蕉皮PPO有同工酶的存在,已有文献报道了牛蒡、草菇、板栗、莲藕等的多酚氧化酶具有同工酶。因此在香蕉贮藏加工中调节pH能减轻香蕉的酶褐变程度。

2.3酶活力与温度的关系 
  温度对多酚氧化酶的影响作用是两面的:随着温度的升高,酶的催化反应速率会得到升高,当温度达到一定程度,就会促使酶蛋白变性失活,是2种对抗效应的综合反应。香蕉皮PPO粗酶液在不同温度下处理5min后的活性如图3所示。由图3可知,香蕉皮PPO的最适温度为35℃,温度低于20℃时酶活力较低,高于40℃酶开始钝化,到75℃以上处理5分钟酶已丧失活性。 
  2.4酶活力与底物浓度的关系 
  如图4可知,在底物浓度较低的时候,随着底物浓度的增加,反应产物的吸光度也是相应增加的,但是当底物浓度增加到0.1 25mol/L之后,增加底物浓度,反应产物的吸光度的变化值不再变化。在底物浓度达到0.25mol/L时,酶活力仍保持一定的反应速度,并没有随底物浓度的增加而对酶活力产生抑制作用。 
  2.6酶活力与酶液保存时间的关系 
  6天内酶活力的变化情况如图6。由图6可以看出,新提取PPO粗酶液活性最大,随着时间的延长,酶活性逐渐降低。可能是因为提取出来的香蕉皮PPO粗酶液在没有其他附作物(纤维素、糖等)的保护下被氧化或降解了。 
  2.7不同褐变抑制剂对酶活力的影响 
  柠檬酸、NaHS03、抗坏血酸、EDTA-2Na 4种褐变抑制剂对酶活力的影响如图7、8、9。 
  由图7可知,随着柠檬酸浓度的增加,酶活力逐渐降低。当柠檬酸浓度达到0.015mol/L的时候,酶活力达到最低,因为柠檬酸的3个羧基对香蕉皮PPO的辅基铜有螯合作用;但是再增加柠檬酸浓度之后,酶活力会先变大再减小,因为柠檬酸能改变反应体系的酸碱环境,正如图2所示在pH值4.5的时候有1个波峰,所以当柠檬酸浓度为0.2 mol/L时会有所增强,在0.3mol/L时,对酶活力的抑制效果最明显。 
  图8可得,NaHS03对PPO酶活力具有较明显的抑制效果。随着NaHS03浓度的增加,酶活力逐渐降低,当NaHS03浓度达到0.04mol/L之后,酶活力降到很低。这是因为NaHS03不可逆地与中间产物醌作用生成无色的产物,并且具有漂白和防止微生物污染的作用。NaHSO3浓度在0.04mol/L时抑制效果最好。 
  由图9可知,抗坏血酸能有效抑制PPO酶活力,当抗坏血酸浓度为0.01 mol/L时,酶液基本失活。抗坏血酸在多酚氧化酶体系中,对酶褐变的抑制机理是与中间产物邻二醌作用生成邻二酸和脱氢抗坏血酸,防止中间产物进一步聚合成黑色素。抗坏血酸和亚硫酸氢钠抑制褐变在其他文献中也有类似结论。 
  而EDTA-2Na却没有抗坏血酸那样显著的抑制效果,EDTA-2Na是常用的金属络合物,主要通过螯合PPO中的辅基铜从而达到抑制酶活力的目的,相对来说抑制效果较差,一般不单独使用。 
  3讨论 
  试验表明,香蕉皮PPO褐变反应的最适测定波长是404nm;PPO在pH值4.5和6.5时有2个峰值,表明PPO有同工酶存在,且在pH值6.5时香蕉皮PPO的活性最大;香蕉皮中PPO的最适温度是35℃,高于40%酶开始钝化,到75%以上处理5mn酶已丧失活性;而赵立的研究结论认为:香蕉皮多酚氧化酶的最适温度为30%,最适pH值为4.5和5.5。鲍金勇的研究结果表明:香蕉皮PPO最适温度为30%、最适pH值5.5、并且香蕉皮PPO有同工酶;上述2项研究内容中关于香蕉皮PPO最适温度是温度梯度为1 0℃,且这2项研究中没有考查35%时的酶活性,因此,本研究认为香蕉皮PPO最适温度为35℃应是更精确的。酶的最适pH值研究结论不一致,可能是供试材料品种不一样所导致的。PPO储存时间越久,其活力会降低;香蕉皮PPO符合动力学方程,相应的动力学方程式为V=0.00924[S]/(0.087922+[S]);0.04mol/L的亚硫酸氢钠和0.01mol/L的抗坏血酸对防止香蕉皮PPO的褐变有明显的抑制作用。


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